數(shù)值孔徑和分辨率

顯微鏡物鏡的數(shù)值孔徑是衡量其在固定物體（或標(biāo)本）距離下工作時(shí)聚集光線和分辨精細(xì)標(biāo)本細(xì)節(jié)的能力的指標(biāo)。成像光波穿過標(biāo)本并以倒置錐體的形式進(jìn)入物鏡，如圖 1(a) 所示。白光由寬光譜的電磁波組成，其周期長度在 400 到 700 納米之間。作為參考，重要的是要知道 1 毫米等于 1000 微米，1 微米等于 1000 納米。綠色光的波長范圍以 550 納米為中心，相當(dāng)于 0.55 微米。如果通過顯微鏡觀察小物體（例如安裝在顯微鏡載玻片上的典型染色標(biāo)本），入射到這些微小物體上的光會發(fā)生衍射，從而偏離原始方向（圖 1(a)）。物體越小，入射光線的衍射就越明顯。數(shù)值孔徑越高，進(jìn)入物鏡前透鏡的斜射線就越多，從而產(chǎn)生分辨率更高的圖像，使更小的結(jié)構(gòu)更清晰地可視化。圖 1(a) 所示的是一個(gè)簡單的顯微鏡系統(tǒng)，由物鏡和樣本組成，樣本被準(zhǔn)直光束照射，如果沒有使用聚光鏡，情況就是這樣。樣本衍射的光呈現(xiàn)為半角 () 的倒錐體，這代表可以進(jìn)入物鏡的光的極限。為了增加顯微鏡的有效孔徑和分辨能力，添加了聚光鏡 (圖 1(b)) 以在樣本的照明側(cè)產(chǎn)生射線錐。這使物鏡能夠收集更大衍射角產(chǎn)生的光線，從而提高顯微鏡系統(tǒng)的分辨率。物鏡和聚光鏡的孔徑角之和稱為 工作孔徑。如果聚光鏡孔徑角與物鏡匹配，則可以獲得最大分辨率。

為了能夠比較兩個(gè)物鏡并獲得分辨率的定量控制，數(shù)值孔徑或物鏡覆蓋的立體角的測量值定義為：

其中α等于物鏡開角的一半，η是物鏡和保護(hù)標(biāo)本的蓋玻片之間使用的浸沒介質(zhì)的折射率（空氣為η=1;油或玻璃為η=1.5）。通過檢查上式，顯然折射率是實(shí)現(xiàn)大于 1.0 的數(shù)值孔徑的限制因素。因此，為了獲得更高的工作數(shù)值孔徑，必須增加物鏡前透鏡和標(biāo)本蓋玻片之間介質(zhì)的折射率。標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡物鏡可獲得的最高孔徑角理論上為 180 度，因此數(shù)值孔徑公式中使用的半角值為 90 度。90 度的正弦等于1，這表明數(shù)值孔徑不僅受孔徑角限制，還受成像介質(zhì)折射率限制。實(shí)際上，只有性能最高的物鏡才能達(dá)到超過 70 到 80 度的孔徑角，而這些物鏡通常要花費(fèi)數(shù)千美元。

光學(xué)顯微鏡的分辨率定義為樣本上兩點(diǎn)之間的最小距離，該距離仍可區(qū)分為兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)體。分辨率與顯微鏡的有效放大倍數(shù)和樣本細(xì)節(jié)的感知極限直接相關(guān)，盡管它在顯微鏡中是一個(gè)有點(diǎn)主觀的值，因?yàn)樵诟叻糯蟊稊?shù)下，圖像可能看起來不清晰，但仍可以最大程度地解析物鏡和輔助光學(xué)元件。由于光的波動(dòng)性質(zhì)以及與這些現(xiàn)象相關(guān)的衍射，顯微鏡物鏡的分辨率由能夠進(jìn)入前透鏡的光波角度決定，因此該儀器被稱為衍射受限。這個(gè)限制純粹是理論上的，但即使是理論上理想的物鏡，沒有任何成像誤差，其分辨率也是有限的。
如果物鏡將細(xì)節(jié)投射到中間圖像平面上，其分辨率小于人眼的分辨率（這種情況在低放大倍數(shù)和高數(shù)值孔徑下很常見），觀察者將錯(cuò)過圖像中的細(xì)微差別。如果圖像被放大到超出圖像的物理分辨率，就會出現(xiàn)空放大現(xiàn)象。出于這些原因，對觀察者來說，有用的放大倍數(shù)最好高于物鏡數(shù)值孔徑的 500 倍，但不能高于數(shù)值孔徑的1000倍。


提高顯微鏡光學(xué)分辨力的一種方法是在物鏡前透鏡和蓋玻片之間使用浸沒液。大多數(shù)放大倍數(shù)在 60 倍至 100 倍（及更高）之間的物鏡都設(shè)計(jì)用于浸沒油。使用折射率為η = 1.51 的油可獲得良好的效果，該折射率與玻璃的折射率精確匹配。通過這種方式可消除從物體到物鏡的路徑上的所有反射。如果不使用這個(gè)技巧，反射總是會導(dǎo)致蓋玻片或大角度情況下的前透鏡上的光線損失（圖 2）。

物鏡的有用數(shù)值孔徑以及分辨力會因上述反射而降低。物鏡的數(shù)值孔徑在一定程度上也取決于光學(xué)像差的校正量。高度校正的物鏡在相應(yīng)放大倍數(shù)下往往具有更大的數(shù)值孔徑，如表 1 所示。

當(dāng)來自標(biāo)本各個(gè)點(diǎn)的光線穿過物鏡并重新組合成圖像時(shí)，標(biāo)本的各個(gè)點(diǎn)在圖像中顯示為小圖案（不是點(diǎn)），稱為艾里斑。這種現(xiàn)象是由光線穿過標(biāo)本中的微小部分和空間以及物鏡的圓形后孔時(shí)發(fā)生衍射或散射引起的。兩個(gè)小物體仍被視為獨(dú)立實(shí)體的極限被用作顯微鏡分辨能力的度量。達(dá)到此極限的距離稱為顯微鏡的有效分辨率，表示為d0。分辨率是一個(gè)可以根據(jù)儀器的光學(xué)參數(shù)和照明的平均波長從理論上推導(dǎo)的值。

首先，重要的是要知道，物鏡和筒鏡不會將物體上的一個(gè)點(diǎn)（例如，金屬箔上的一個(gè)微小孔）成像為具有清晰邊緣的明亮圓盤，而是成像為被衍射環(huán)包圍的略微模糊的點(diǎn)，稱為艾里斑（見圖 3(a)）。中間像平面附近的衍射圖案的三維表示稱為點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)（圖 3(b)）。艾里斑是艾里圖案的第一個(gè)最小值所包圍的區(qū)域，包含約 84% 的光能，如圖 3(c) 所示。點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)是艾里斑的三維表示。

分辨率可根據(jù) 19 世紀(jì)末恩斯特·阿貝 (Ernst Abbe) 提出的著名公式計(jì)算，該公式表示光學(xué)顯微鏡的圖像清晰度：

其中λ為光的波長， η表示如上所述的成像介質(zhì)的折射率，組合項(xiàng) η? SIN(α)稱為物鏡數(shù)值孔徑 (NA)。顯微鏡中常用的物鏡的數(shù)值孔徑小于 1.5，將上式中的項(xiàng)α限制為小于 70 度（盡管新的高性能物鏡非常接近此極限）。因此，當(dāng)使用數(shù)值孔徑為 1.40 的物鏡時(shí)，最短實(shí)用波長（約 400 納米）的理論分辨率極限在橫向尺寸上約為 150 納米，在軸向尺寸上接近 400 納米。因此，使用顯微鏡無法在橫向平面上分辨距離小于此距離的結(jié)構(gòu)。由于成像介質(zhì)的折射率和物鏡的角孔徑之間的相互關(guān)系具有重要意義，Abbe 在解釋顯微鏡分辨率的過程中引入了數(shù)值孔徑的概念。

艾里斑中的衍射環(huán)是由物鏡孔徑的限制功能引起的，因此物鏡充當(dāng)一個(gè)孔，衍射環(huán)位于其后。物鏡和聚光鏡的孔徑越大，d0就越小。因此，整個(gè)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑越高，分辨率就越好。與原始阿貝公式相關(guān)的幾個(gè)方程式之一，用于表達(dá)數(shù)值孔徑、波長和分辨率之間的關(guān)系：

其中λ是光的成像波長， NAcon是聚光鏡數(shù)值孔徑，NA obj等于物鏡數(shù)值孔徑。系數(shù) 1.22 取自下圖中所示的兩個(gè)艾里斑接近時(shí)的計(jì)算結(jié)果，其中強(qiáng)度分布已疊加。如果兩個(gè)圖像點(diǎn)彼此相距較遠(yuǎn)，則很容易將它們識別為單獨(dú)的物體。但是，當(dāng)艾里斑之間的距離不斷減小時(shí)，當(dāng)?shù)诙€(gè)艾里斑的主最大值與第一個(gè)艾里斑的第一個(gè)最小值重合時(shí)，就會達(dá)到極限點(diǎn)。疊加的分布顯示兩個(gè)亮度最大值，它們之間有一個(gè)谷值。谷底的強(qiáng)度與兩個(gè)極大值相比降低了約 20%。這剛好足以使人眼看到兩個(gè)獨(dú)立的點(diǎn)，這一極限被稱為瑞利判據(jù)。

比較一下可能有助于理解這一點(diǎn)。電話線不太可能用于小提琴微妙聲音的電子傳輸，因?yàn)檫@種介質(zhì)的帶寬非常有限。如果使用高質(zhì)量的麥克風(fēng)和放大器，其頻率范圍與人類的聽覺范圍相同，則可以獲得更好的效果。在音樂中，信息包含在中等聲音頻率中；然而，聲音的細(xì)微差別包含在高泛音中。在顯微鏡中，結(jié)構(gòu)的細(xì)微之處被編碼到衍射光中。如果您想在物鏡后面的成像空間中看到它們，您必須確保它們首先被物鏡收集。隨著孔徑角的增大和數(shù)值孔徑的增大，這變得更容易。
物鏡的數(shù)值孔徑隨著放大倍數(shù)的增加而增加，最高可達(dá) 40 倍（見表 1 和表 2），但對于油浸版本，數(shù)值孔徑在 1.30 和 1.40 之間穩(wěn)定（取決于像差校正程度）。表 2 列出了研究和教學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用物鏡的分辨率計(jì)算值。表中列出了樣本的點(diǎn)對點(diǎn)分辨率d0，以及中間目鏡平面（使用 550 納米波長的綠光）中圖像的放大尺寸 (D0)。此外，表中的n值表示如果它們沿 20 毫米的視場直徑排列成線性陣列（20/D0毫米），則解析像素的數(shù)量。

如果物鏡在低數(shù)值孔徑下無法提供足夠的像素，則不應(yīng)嘗試使用提供高附加放大倍數(shù)（例如 16 倍、20 倍或 25 倍）的目鏡或其他光學(xué)后燃器來增加顯微鏡的整體放大倍數(shù)。另一方面，如果物鏡將非常精細(xì)的細(xì)節(jié)投射到中間圖像上，并且您使用的是放大倍數(shù)較低的目鏡，您將錯(cuò)過細(xì)微的差別。為了在光學(xué)顯微鏡中觀察精細(xì)的標(biāo)本細(xì)節(jié)，標(biāo)本中存在的微小特征必須具有足夠的對比度，并以略大于人眼角分辨力的角度投射中間圖像。如前所述，顯微鏡的整體組合放大倍數(shù)（物鏡和目鏡）應(yīng)高于 500 倍，但低于 1000 倍物鏡孔徑。該值稱為有用放大倍數(shù)的范圍。
在日常的常規(guī)觀察中，許多顯微鏡專家并不會嘗試用他們的設(shè)備實(shí)現(xiàn)盡可能高的圖像分辨率。顯微鏡的分辨率是光學(xué)系統(tǒng)最重要的特性，它會影響區(qū)分特定樣本精細(xì)細(xì)節(jié)的能力。決定分辨率的主要因素是物鏡數(shù)值孔徑，但分辨率還取決于樣本的類型、照明的相干性、像差校正程度以及其他因素，例如顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)或樣本本身的對比度增強(qiáng)方法。

現(xiàn)代顯微鏡物鏡允許在實(shí)踐中實(shí)現(xiàn)理論分辨力，前提是觀察合適的標(biāo)本。但是，有幾個(gè)提示可以確保成功。這些提示如下。

物鏡和標(biāo)本是否干凈？空氣物鏡前透鏡上的指紋可能足以影響標(biāo)本的高對比度圖像再現(xiàn)，這是由于不必要的散射光造成的。同樣的警告也適用于被樹脂或乳液殘留物（如油和水）弄臟的浸沒式物鏡。在這些情況下，使用軟布和鏡頭清潔劑或純乙醇仔細(xì)清潔物鏡前透鏡元件應(yīng)該可以緩解問題。

蓋玻片的厚度是否正確？與高孔徑（大于 0.65）物鏡匹配的蓋玻片具有 170 微米的標(biāo)準(zhǔn)厚度至關(guān)重要，因?yàn)樵谠O(shè)計(jì)物鏡時(shí)會考慮蓋玻片厚度。因此，如果使用不同厚度的蓋玻片（小于 165 微米或大于 175 微米），光學(xué)圖像的質(zhì)量會明顯受到影響。一般來說，數(shù)值孔徑為 0.7 或更高的物鏡的經(jīng)驗(yàn)法則是，它們可以容忍 10 微米的變化，而數(shù)值孔徑較低的物鏡（0.3 到 0.7）可以容忍更高的偏差，通常高達(dá) 30 微米。

您使用的浸油正確嗎？ 所有數(shù)值孔徑大于 0.95 的物鏡都設(shè)計(jì)用于浸沒介質(zhì)（通常為折射率為 1.515 的油）。浸油不含多氯聯(lián)苯，幾乎不顯示任何自發(fā)熒光。如果浸沒層中引入氣泡，圖像將明顯受損，因此必須小心涂油以避免產(chǎn)生氣泡。取下目鏡，通過顯微鏡觀察筒（或使用伯特蘭透鏡）檢查物鏡后焦平面，即可輕松看到氣泡。如果發(fā)現(xiàn)氣泡，應(yīng)清潔物鏡和載玻片，并小心地重新涂上油。